جلسه دفاع رساله: محمد خالدی، گروه بیوشیمی

ارائه کننده: محمد خالدی

استاد راهنما: دکتر سامان حسینخانی

استاد مشاور: دکتر فرنگیس عطایی

داور داخلی: دکتر رضا حسن ساجدی، دکتر مهرداد بهمنش

داور خارجی: دکتر میترا نوربخش، دکتر آزاده ابراهیم حبیبی

نماینده تحصیلات تکمیلی: دکتر رضا حسن ساجدی

تاریخ : ۱۴۰۴/۰۳/۳۰

ساعت: ۱۵ تا ۱۷

مکان: سالن طبقه ۱- علوم پایه

چکیده:

پیروپتوز نوعی مرگ برنامه‌ریزی‌شده سلولی است که در پاسخ به عفونت‌های میکروبی و استرس‌های درونی فعال می‌شود. پروتئین Gasdermin D (GSDMD) به عنوان پروتئین عملکردی اصلی پیروپتوز شناخته می‌شود که پس از برش توسط کاسپازهای التهابی، پایانه آمینی آن الیگومریزه شده و با تشکیل منفذ در غشای سلول، منجر به لیز آن و آزادسازی سایتوکاین‌های التهابی می‌گردد. هدف از این مطالعه، بررسی میان‌کنش مونومرهای پایانه آمینی GSDMD با استفاده از گزارشگر لوسیفراز قطعه‌ای و مطالعه اثر جهش‌ها بر ساختار و عملکرد این پروتئین است.

در این مطالعه، توالی پایانه آمینی ژن GSDMD متناسب با فراوانی کدونی باکتری E. coli بهینه‌سازی و در پلاسمید (+) pET28a کلون گردید. در طی فرآیند سنتز و کلونینگ، جهش‌های متعددی از جمله G154S، G211S، C191Y-A219T و N271T-F272S به طور تصادفی ایجاد شد. فعالیت این واریانت‌ها با کشت بر روی پلیت LB-agar حاوی IPTG ارزیابی گردید. واریانت‌های G154S،G211S و N271T-F272S رشد ضعیفی نشان داده و به عنوان فرم‌های فعال در نظر گرفته شدند، در حالی که واریانت C191Y-A219T رشد طبیعی داشته و غیرفعال درنظر گرفته شد. به منظور بررسی برهمکنش‌ و تخلیص مونومرها، سازه‌های لوسیفرازی (N-luc و C-luc) و همچنین سازه MBP-TEV-GSDMD-NT طراحی و کلون گردیدند. بیان پروتئین با روش SDS-PAGE و فعالیت لوسیفرازی با لومینومتر ارزیابی شد. درنهایت شبیه‌سازی دینامیک مولکولی، بررسی پایداری ساختاری و انرژی اتصال واریانت‌ها انجام گرفت.

ابتدا تایید شد که ترکیب Necrosulfonamide اولیگومریزاسیون پایانه آمینی gasdermin D و تشکیل منفذ را در سلول‌های HEK293 مهار می‌کند؛ این امر با افزایش فلورسانس EGFP-GSDMD-NT در غلظت‌های پایین NSA و کاهش سیگنال در دوزهای بالاتر به دلیل سمیت سلولی اثبات شد. در میزبان پروکاریوتی، هیچ یک از سازه‌های لوسیفرازی و MBP-GSDMD-NT واریانت N271T-F272S بیانی نداشتند در حالی که واریانت غیرفعال C191Y-A219T، بیان پروتئین مناسبی نشان داد. شبیه‌سازی‌های دینامیک مولکولی نشان داد که دایمر نوع وحشی با انعطاف‌پذیری بالا در loop حاوی C191، پیوند محکمی برقرار می‌کند. جهش G154S، انعطاف‌پذیری این loop و پایداری فرم دایمر را تا حدودی کاهش داد. جهش G211S نیز ضمن حفظ انعطاف‌پذیری loop دربرگیرنده C191، linker ناحیه ۸۸–۱۰۰ را سخت تر کرده و منجر به کاهش پایداری فرم دایمر شد. در مقابل، جهش دوگانه C191Y-A219T باعث ناپایداری شدید و برهمکنش ضعیف بین مونومرها شد که میتواند توجیه‌کننده غیرفعال بودن آن باشد. این پژوهش، ظرفیت سازگاری باکتری‌ها را تحت استرس بیان پروتئین سمی را نشان داد که می تواند به درک تکامل رفتاری میزبان-پاتوژن کمک کند.